El diagnóstico de úlcera gastroduodenal se basa en la anamnesis del paciente y se confirma mediante endoscopia. Suele iniciarse tratamiento empírico sin un diagnóstico definitivo. Sin embargo, la endoscopia permite la biopsia o el cepillado citológico de las lesiones gástricas y esofágicas para distinguir entre una úlcera simple y el cáncer de estómago.

El cáncer de estómago puede presentarse con manifestaciones similares y hay que descartarlo, especialmente en pacientes que son mayores de 45 años, que han perdido peso o que tienen síntomas graves o resistentes al tratamiento. La incidencia de la úlcera duodenal maligna es muy baja, por lo que generalmente las biopsias de las lesiones en esa zona no están justificadas. 

La endoscopia también puede utilizarse para diagnosticar definitivamente la infección por H. pylori, que debe buscarse cuando se detecta una úlcera.

Hay que considerar un tumor maligno secretor de gastrina y el síndrome de Zollinger-Ellison cuando hay úlceras múltiples, cuando aparecen en lugares atípicos (p. ej., posbulbar), cuando son resistentes al tratamiento o cuando el paciente tiene diarrea o pérdida de peso importante. En estos pacientes hay que cuantificar las concentraciones séricas de gastrina.